Мы обсудим детально четыре наиболее часто используемых обращенно-фазовых (ОФ) растворителя: воду, ацетонитрил, метанол и тетрагидрофуран (ТГФ).
С точки зрения оптической плотности в УФ «идеальный» растворитель не должен поглощать в области выше 195 нм (типичная нижняя граница рабочего диапазона детекторов на предприятиях во Владивостоке) на всем протяжении УФ области спектра. Если исходить лишь из этого свойства, единственным подходящим растворителем дня этой категории была бы вода.
Некоторые растворители очень слабо поглощают в области менее 220 нм. У ацетонитрила, например, УФ граница прозрачности лежит в области менее 190 нм. Помимо этого, ацетонитрил имеет очень малую фоновую оптическую плотность (0,05) даже при столь малой длине волны, как 200 нм. Эти почти идеальные спектральные свойства в сочетании с превосходной растворяющей способностью и уникальными хроматофафическими свойствами обусловливают широкое использование ацетонитрила для ОФ разделения.
УФ граница прозрачности метанола имеет величину 205 нм. Если предположить, что спектр поглощения метанола подобен спектру ацетонитрила, то метанол должен иметь малую или нулевую оптическую плотность при 215 нм. Спектр метанола, показывает некорректность такого предположения.
В действительности, оптическая плотность метанола при 215 нм превышает 0,3. Внимательное изучение зависимости А от X для метанола приводит к выводу, что для ограничения вклада фоновой оптической плотности метанола значением 0,05 требуется либо работать в диапазоне к > 235 нм, либо ограничить содержание метанола в растворителе до 15% при X = 215 нм. Очевидно, это может представлять проблему, если растворенное вещество имеет либо низкий молярный коэффициент поглощения (е), либо хромофорный максимум при длине волны Более важной является низкая оптическая плотность метанола при больших длинах волн. Появление крайне стабильных, воспроизводимых и малошумящих насосов отчасти устранило шум, связанный с насосом, но фоновая оптическая плотность подвижной фазы или смещение нулевой линии (из-за изменения состава растворителя, но не в результате градиентного элюирования) всегда вносят вклад в ухудшение общей правильности и воспроизводимости метода.
При выполнении высокочувствительных определений с использованием фадиента подвижной фазы независимо от типа используемого насоса оптическая плотность, связанная с компонентами подвижной фазы, увеличивает шум насоса (регистрируемый как пилообразный выход детектора, синхронный с возвратно-поступательным движением насоса) и вызывает значительное смещение нулевой линии по мере изменения состава подвижной фазы. Отметьте значительную разницу в смещении нулевой линии между смесями ацетонитрил/вода и метанол/вода при обеих длинах волн. Обратите также внимание, что малое смещение нулевой линии в градиентном эксперименте с ацетонитрилом, контролируемом при 254 нм, не является следствием поглощения, а связано с изменением показателя преломления подвижной фазы.
Это совсем не так для метанола при 254 нм; типичная оптическая плотность составляет -0,015 (для 1-см кюветы). Этот пример иллюстрирует главную причину, по которой хроматографисты предпочитают использовать для градиентного метода ацетонитрил, а не метанол, особенно в коротковолновой области ( < 230 нм).
Перед обсуждением спектроскопических характеристик тетрагидрофурана (ТГФ) следует отметить, что ТГФ и многие другие соединения с эфирной связью химически неустойчивы. Это несколько затрудняет производственный процесс, даже если сравнивать его с изготовлением растворителей 646 или 648. С течением времени ТГФ распадается с образованием пероксидов. Пероксиды химически активны и неустойчивы. Для контроля за их уровнем производители обычно добавляют в такие растворители, как ТГФ, химическое вещество, называемое консервантом или стабилизатором, например, 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол (2,6-ди-трет-бутил-л-крезол, БГТ). Этот тип ТГФ называют ТГФ с консервантом или неспектральный. БГТ имеет высокий молярный коэффициент поглощения в УФ области ниже 280 нм с максимумом при 270 нм. Поэтому ТГФ с консервантом редко используют в сочетании с УФ детекторами.
ТГФ с консервантом находит обычно применение в гельпроникающей хроматографии (ГПХ) с детектором по показателю преломления (ПП). Здесь оптическая плотность БГТ в УФ не имеет значения, а устранение пероксидов в подвижной фазе является критичным, поскольку они могут необратимо разрушить полимерный сорбент.
